丁苯酞最新研究成果
發布日期：2022-03-23 09:32研究結果證明：雙側頸外靜脈閉塞對正常大鼠不造成嚴重影響，但會加劇大腦中動脈閉塞（MCAO）型大鼠的腦損傷。丁苯酞治療主要是通過促進腦血流恢復和保護血腦屏障對伴有靜脈引流障礙的MCAO大鼠起到神經保護作用。
研究背景
靜脈系統是血液循環的流出通道和血液儲備器官，對調節顱內壓、維持血腦屏障(BBB)的完整性具有重要作用。同時，靜脈血在血液儲存中扮演重要作用，其中腦血容量的70-80%儲存于靜脈系統中。靜脈系統在維持中樞神經系統正常功能中發揮重要作用，既往研究提示，自發性顱內壓增高與完全或部分的頸內靜脈閉塞相關。腦靜脈異?？蓪е乱幌盗兄袠猩窠浵到y疾病，如腦水腫、高顱壓頭痛、短暫性單眼失明、癲癇以及皮質發育異常等。有證據表明，靜脈引流障礙可加重缺血性卒中，如閉塞MCAO大鼠的雙側頸外靜脈將顯著增加梗死體積。在臨床上，皮質靜脈充盈緩慢及充盈范圍差與預后不良相關，動態CT血管造影（dCTA）靜脈相晚期皮質靜脈充盈延遲被認為是急性缺血性卒中（AIS）患者溶栓治療后再灌注不良的標志。同側靜脈引流障礙的AIS患者更容易發生早期致命性水腫。然而，靜脈循環缺陷引起的缺血性卒中不良反應的機制尚不清楚，也沒有關于伴有靜脈引流障礙的AIS的針對性治療的報道。
丁苯酞是一種用于治療缺血性卒中的小分子多靶點藥物，具有恢復腦動脈管徑、促進血管生成、促進軸突生長和神經發生等多種作用。但丁苯酞是否對伴有靜脈循環障礙的AIS患者具有相同的神經保護作用目前尚不清楚?，F實世界中，超過20%的人存在靜脈結構異常，因此伴有腦靜脈障礙的缺血性卒中的潛在治療方法值得進一步探索。
研究方法
通過永久性閉塞SD大鼠的雙側頸外靜脈制備腦靜脈引流障礙（EJVO）模型，并通過永久性閉塞其右側大腦中動脈（MCAO）模擬缺血性卒中模型。將310只成年雄性Sprague-Dawley大鼠（周齡8，300-380g）分為假手術（Sham）組、頸外靜脈閉塞（EJVO）組、MCAO組、頸外靜脈閉塞+大腦中動脈閉塞（EJVO+MCAO）組，和頸外靜脈閉塞+大腦中動脈閉塞+丁苯酞治療（EJVO+MCAO+NBP）組，共5組。分別通過TTC染色、磁共振、伊文斯蘭外滲及行為學試驗評估梗死體積、腦血流量（cerebralblood flow, CBF）、血腦屏障完整性和神經功能。通過免疫熒光染色和westernblot（WB）評估神經元、內皮細胞、周細胞和緊密連接的丟失程度。
研究結果
（一）NBP可減少靜脈循環障礙引起的梗死體積增加
為探討雙側頸外靜脈阻塞是否會增加梗死體積，研究選擇MCAO術后24和72小時兩個時間點進TTC染色測量梗死體積。結果顯示在兩個時間點，伴有靜脈循環障礙的MCAO大鼠梗死體積均較單純MCAO組大鼠明顯增大。在伴有靜脈循環障礙的MCAO大鼠中，NBP治療3天可減少梗死面積（圖1）。
（二）NBP可減輕由靜脈循環障礙加劇的神經功能惡化
為了評估MCAO后的神經損傷和NBP的治療效果，并評估腦靜脈引流障礙是否會對大鼠的神經功能產生影響，研究動態觀察了每只動物的運動和感覺功能。雙側頸外靜脈閉塞對正常大鼠的神經行為學評分無顯著影響，但對皮層梗死的大鼠的神經行為學評分有顯著影響。與假手術組大鼠相比，伴有或不伴有靜脈循環障礙的MCAO大都存在明顯的神經損傷，且伴有靜脈循環障礙的皮質梗死大鼠展現出更嚴重的神經損傷，主要表現為前肢抓力更差（圖2a），平衡木實驗評分更高（圖2b），除膠時間更長（圖2c）。與安慰劑對照組相比，接受NBP治療的大鼠神經功能更好（圖2a-c）。
（三）NBP減少MCAO和EJVO后神經元損傷
通過HE染色觀察神經元形態，如（圖3a）所示。隨著病情的進展，核膜破裂，細胞質與細胞核內容物混合，提示神經細胞受損。與假手術組相比，接受MCAO手術的大鼠表現出更明顯的神經元損傷。EJVO+MCAO組神經元損傷更早發生，且損傷更為嚴重。在EJVO+MCAO大鼠中，NBP治療組的神經元損傷較未治療組程度更輕，核破裂發生更晚。
尼氏染色觀察神經元內的尼氏小體。如（圖3b）所示，假手術組和EJVO組的大鼠尼氏小體幾乎不受影響，而在MCAO、EJVO+MCAO和EJVO+MCAO+NBP組中，尼氏染色顯示神經元排列紊亂，早期即出現大量暗神經元，尼氏染色陽性的細胞數明顯低于假手術組。與EJVO+MCAO組相比，MCAO組和EJVO+MCAO+NBP組的尼氏染色陽性細胞數更多，這表明EJVO加重了MCAO組大鼠的神經元損傷，而NBP處理保護了部分神經元。
為了分析梗死區存活的神經元細胞，研究利用NeuN的特異性免疫熒光染色標記神經元。圖3c為皮層梗死區域的神經元。EJVO手術后大鼠的神經元與假手術組無明顯差異。MCAO導致神經細胞顯著丟失，EJVO+MCAO組大鼠的神經細胞丟失程度較MCAO組大鼠更嚴重，從術后第3天開始差異具有統計學意義。在伴有靜脈循環的MCAO大鼠中，與安慰劑組相比，NBP治療組的損傷更輕（圖3d）。通過westernblotting驗證NeuN蛋白濃度與免疫熒光一致（圖3e-h）。這些發現表明，一旦發生腦梗死，靜脈循環障礙的存在會加重神經元損傷。然而，NBP對伴有靜脈障礙的MCAO大鼠有保護作用。
（四）NBP促進伴有靜脈循環障礙的MCAO大鼠微血管生成
為了探討靜脈循環障礙對腦梗死后血管生成的影響，研究通過免疫熒光法測定腦組織切片中CD31的覆蓋率，并通過westernblot方法評估缺血腦組織中CD31的總濃度。結果顯示，EJVO組CD31水平略有下降，但差異無統計學意義（圖4）。無論是否伴有靜脈循環障礙，MCAO后第1天CD31顯著減少。在術后第3天，單純MCAO組CD31明顯改善，恢復至正常水平；然而，EJVO+MCAO組顯示CD31僅有輕度增加。EJVO+MCAO組與假手術組、EJVO組和MCAO組之間仍存在顯著的統計學差異。在術后第7天，EJVO+MCAO組CD31恢復至正常水平，但仍明顯低于單純MCAO組。在術后第14天，MCAO組的CD31水平顯著高于假手術組，而EJVO+MCAO組的CD31水平有所升高，但無統計學差異。在伴有靜脈循環障礙的MCAO大鼠中，NBP治療可以顯著增加血管內皮密度。作為體內的第三級側支循環，血管新生是腦血流的恢復重要助力。本研究結果表明，雙側頸外靜脈閉塞導致的靜脈循環障礙會阻礙梗死區的新生血管形成，而NBP治療可促進這些大鼠的血管新生。
（五）NBP可降低結扎靜脈遠端壓力升高的程度
如圖5所示，在8個時間點進行了頸外靜脈壓力的測量，即術前、術后即刻、2小時、6小時、12小時、1天、3天和7天。結扎雙側頸外靜脈可導致頸外靜脈壓力立即升高，升高的頸外靜脈壓在術后2小時開始下降，在術后第3天已恢復至正常水平。單純MCAO手術不會導致頸外靜脈壓力增加。與EJVO組相似，在EJVO+MCAO和EJVO+MCAO+NBP組中，研究發現術后即刻頸外靜脈壓力顯著升高。在EJVO+MCAO組中，升高的頸外靜脈壓力至少持續3天，而在NBP治療組中，這種狀態僅持續不到1天。NBP治療有助于EJVO+MCAO大鼠的靜脈循環的恢復，降低頸外靜脈壓力。
（六）NBP促進靜脈循環障礙大鼠MCAO后CBF的恢復
在本研究中，3DASL用于大鼠CBF的動態評估。在5個時間點對梗死的皮質區（或非MCAO大鼠的相應腦區）進行CBF值的測量，即術前、術后即刻以及術后第3天、7天和14天。在EJVO組大鼠中，術后即刻出現了短暫的CBF下降，下降的CBF值在第3天恢復正常。MCAO組大鼠的CBF顯著下降，但EJVO+MCAO組下降更為嚴重。與EJVO+MCAO組相比，NBP治療組大鼠的CBF恢復更快。結果表明，MCAO大鼠腦血流量顯著下降，EJVO延緩了MCAO大鼠腦血流量的恢復。NBP治療可加速EJVO+MCAO大鼠的CBF恢復。CBF圖和相對值的定量分析如圖6a和b所示。
（七）NBP可減輕靜脈循環障礙引起的BBB損傷
研究通過測定EB外滲來評估BBB的完整性。EB在體內循環3小時后，將大腦切片用于拍照和測量吸光度，如圖7a所示。雙側頸外靜脈閉塞不會導致明顯的EB外滲，而在MCAO后，EJVO在很大程度上加重了BBB損傷（圖7b）。單純MCAO大鼠的EB外滲在術后14天恢復至正常，但EJVO+MCAO組大鼠的EB外滲在整個研究期間均保持在較高水平。NBP治療減輕了伴靜脈循環障礙的MCAO大鼠的EB外滲（圖7a和b）。課題組通過測量腦含水量評估腦水腫程度。如圖7c，EJVO組大鼠的腦含水量在術后第1天短暫升高，并迅速恢復至正常，提示急性腦靜脈循環障礙可能導致短暫的腦水腫。此外，與假手術組相比，MCAO組大鼠的在術后第1天至第7天存在腦水腫。在伴有靜脈循環障礙的MCAO組中大鼠的腦水腫程度比單純MCAO大鼠更為嚴重，這提示靜脈循環障礙對腦水腫產生不利影響。此外，當單純MCAO大鼠的腦含水量在術后第14天恢復到正常水平時，EJVO+MCAO組的腦含水量明顯高于假手術組。NBP治療3天后可減輕伴有靜脈循環障礙的MCAO大鼠的腦水腫程度。
（八）NBP降低了MCAO和EJVO對BBB完整性的破壞
周細胞是包饒內皮細胞的一種細胞，是血腦屏障的重要組成部分。周細胞也分布于小靜脈和小動脈，具有收縮和遷移的能力。為了探討本研究中周細胞的變化，研究選擇用PDGFRβ和Desmin雙重標記周細胞。無論是否存在靜脈循環障礙，接受MCAO手術的大鼠在術后1天均出現周細胞減少。術后第1天，EJVO+MCAO大鼠的PDGFRβ和Desmin水平顯著低于MCAO大鼠。術后第3天，MCAO組周細胞顯著增多，遠高于正常水平，而EJVO+MCAO組術后第3天PDGFRβ和Desmin均升高至正常水平，且明顯低于MCAO組。所有接受MCAO手術的大鼠（伴或不伴EJVO）在7天后缺血區周細胞數量均增加，而單純MCAO組大鼠的增加更為顯著。NBP治療可以在早期減少周細胞的丟失，并在后續過程中更大程度上增加PDGFRβ和Desmin水平（圖8）。
此外，包括ZO-1和Occluding在內的緊密連接蛋白在MCAO術后顯著降低；而單純EJVO組大鼠的緊密連接蛋白在整個研究期間沒有明顯變化。通過評估伴或不伴靜脈引流障礙的MCAO大鼠的ZO-1水平，研究發現伴或不伴EJVO的MCAO兩組大鼠的ZO-1水平在術后第7天開始有顯著差異。在術后14天時，單純MCAO組ZO-1恢復至正常水平，而EJVO+MCAO組仍低于正常。NBP治療可以明顯提高EJVO+MCAO大鼠的ZO-1水平，尤其是在治療7天后（圖9）。Occludin的下降同樣見于MCAO術后，且在EJVO+MCAO下降程度更為嚴重。NBP治療3天后Occludin水平明顯升高（圖9）。上述研究結果提示，腦靜脈引流障礙將加劇MCAO后的BBB損傷，NBP治療對伴有靜脈引流障礙的MCAO大鼠的BBB具有保護作用。
綜上所述，本研究結果表明閉塞雙側頸外靜脈對正常大鼠沒有顯著影響，但在大腦中動脈閉塞的情況下，閉塞雙側頸外靜脈會加重腦損傷。NBP可以通過促進腦血流恢復和保護血腦屏障對伴有靜脈引流障礙的MCAO大鼠起到神經保護作用，本研究是NBP對改善靜脈回流障礙卒中的首次探索，為未來開展相關臨床提供了理論依據。